細胞繼代培養

前言：
1. 細胞生長至高密度時，即須收集細胞，分殖至新的培養瓶中，其稀釋比例依細胞種類而異。
2. 收集細胞方法可用trypsin-EDTA、cell scraper、離心處理等，處理方法依細胞種類而異。
3. Trypsin-EDTA為收集吸附型細胞常用之方法。 Trypsin為胰蛋白酵素，其作用為分解細胞與瓶壁之附著蛋白， EDTA為chelating agent，其作用為去除Ca2+、Mg2+等離子，trypsin與EDTA二者共同作用，可使附著之細胞自瓶壁脫落。除了trypsin-EDTA，亦可使用cell scraper（細胞刮勺）刮落細胞。
4. Trypsin-EDTA作用時間勿太久，否則可能對細胞造成傷害或死亡。敲拍培養瓶不可太過猛烈，避免對細胞造成傷害或造成培養瓶裂痕而污染。
材料：
1. Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca++/Mg++ free
2. trypsin-EDTA solution （0.05% trypsin-0.53mM EDTA.4Na）：若為大體積包裝，建議將其以少量分裝于無菌試管中，保存于-20°C，避免反復冷凍解凍造成trypsin之活性降低，并可減少污染之機會。使用前放在37°C水槽中回溫。
3. 新鮮培養基
4. 無菌吸管/離心管/培養瓶。
步驟：
1. 附著型細胞（adherent cell）
  1. 吸掉舊培養液。
  2. 用Dulbecco's phosphate-buffered saline洗滌細胞一至二次。
  3. 加入trypsin-EDTA溶液（1ml/T-25 flask， 2ml/T-75 flask）：
    1. 方法一：37°C或室溫作用數分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當細胞將要分離而呈現圓粒狀時，吸掉trypsin-EDTA溶液，輕敲培養瓶邊緣使細胞自瓶壁脫落，然后加入適量之新鮮培養基，與脫落之細胞或細胞團塊混和均勻后，依稀釋比例轉移至新的培養瓶中，依正常條件繼續培養之。
    2. 方法二：37°C或室溫作用數分鐘，待細胞自瓶壁脫落后，加入適量含血清之新鮮培養基，以終止trypsin作用（因血清中含有trypsin inhibitor，可以終止trypsin作用），離心后去除上清液，或不作離心處理，添加新鮮培養基后依稀釋比例轉移至新的培養瓶中，依正常條件繼續培養之。
2. 懸浮型細胞（suspension cell）
  1. 吸出細胞培養液，放入離心管中，離心1000 rpm、 5分鐘。
  2. 吸除上清液，加入適量之新鮮培養基，與沉淀細胞（cell pellet）混和均勻后，依稀釋比例轉移至新的培養瓶中，依正常條件繼續培養。
3. 融合瘤（hybridoma）
  1. 有些hybridoma cell需培養三天以上才會產生抗體，若是更換培養基，則可能會失去抗體。因此繼代培養不需離心后更換培養基，直接添加新鮮培養基稀釋細胞濃度即可。

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標簽：細胞培養廢液抽吸 Biovac240

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